食用菌学报@2016．23(2)：79～83 DoI：10．16488／j．cnki．1005—9873．2016．02．016 樟芝子实体和菌丝体萃取物的抑菌及抗氧化活性 汪雯翰1，孙太萍2，杨海芮3，张劲松1，周凯强2，刘志东4，贾薇¨ (·上海市农业科学院食用菌研究所，农业部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心， 国家食用菌加工技术研发分中心，上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海201403； z淮阴师范学院生命科学学院，江苏淮安223300；3石河子大学生命科学学院，新疆石河子832003； 4中国水产科学研究院东海水产研究所，上海200082) 摘要：以樟芝(死fw口，l咖愕“s∞mp^D旭ms)子实体、液体发酵菌丝体和固体培养茵丝体为研究对象，分别 利用石油醚、氯仿和正丁醇有机溶剂进行萃取，获得相应的萃取物，测定其抑菌和抗氧化活性。结果表明：子 nHrel‘s)有较好 实体氯仿和正丁醇萃取物以及固体发酵菌丝体氯仿萃取物对金黄色葡萄球菌(smp_}lyjDcDcc“s 的抑制效果；子实体石油醚、氯仿、正丁醇萃取物和固体发酵菌丝体氯仿萃取物对枯草芽孢杆菌(肋cifjHs 跚6fff括)有较好的抑制效天辰娱乐注册果，并且子实体氯仿萃取物对供试菌的抑菌效果均好于其它萃取物；子实体氯仿、正 丁醇萃取物和固体发酵菌丝体氯仿萃取物具有超氧阴离子清除能力，清除超氧阴离子的ICso值分别为5．94、 1．32和1．97 mg／mL；子实体石油醚、氯仿和正丁醇萃取物具有过氧化氢的清除能力，清除过氧化氢的Icso值 分别为0．13、O．11和O．18mg／mL。 关键词：牛樟芝；萃取；抑菌圈；抗氧化 樟芝(死iM，lDm，I蹦sc口mp．}IDr口fHs)，又名樟菇，红樟芝，血灵芝，是我国台湾特有的一种珍贵食 药用真菌口]，在台湾民间素有“阴阳对口菇”之称，被人们形容为救人于阴阳两届的“灵丹仙药蚍2。]。 它生长于平均海拔1000m以上的潮湿深山密林中主页,(墨月城娱乐),主页，腐生于台湾特产的珍贵树木一樟芝的树洞内或 枯死倒状的树干阴暗潮湿面。近年来，从天然产物中寻找和发掘安全、高效的抗菌资源成为一大研 究热点H]。马刚等研究发现樟芝挥发油对棉花枯萎病菌和沙门氏菌具有较强的抑菌活性[5]。SHU 等人发现培养基pH值为5．0时樟芝菌丝体和发酵液甲醇提取物的抗氧化能力较高[6]。MAU等人 研究了樟芝红菌丝体和白菌丝体甲醇提取物的抗氧化活性，发现白菌丝体抗氧化活性和还原力比红 菌丝体好[7]。韩金龙等人的研究表明樟芝菌丝体提取物的还原能力高于发酵液提取物，还原力最佳 的为菌丝体乙醇提取物；樟芝发酵液提取物的DPPH自由基清除能力高于菌丝体提取物的清除能 力[8]。人工栽培的樟芝子实体由于原材料价格高、栽培技术复杂不易掌握，每公斤的售价在几万元， 而通过液体发酵的菌丝体售价仅为每公斤几百元，固体发酵的菌丝体则更为便宜，因而在产品开发 过程中，利用液体深层发酵或固体发酵菌丝体全部或部分替代子实体将大大降低产品成本，但是目 前对这三者的生物活性差异少有系统研究，因此笔者比较了樟芝子实体、液体深层发酵菌丝体和固 体发酵菌丝体不同有机溶剂萃取物的抑菌和抗氧化活性，为进一步合理开发利用樟芝资源、开发相 关功能食品和保健品提供参考。 1材料与方法 1．1材料 樟芝(丁．c口m础Dr口f“s)子实体为椴木栽培子实体，购自台湾德士通生物科技有限公司。樟芝菌株 收稿日期：2016—04—03原稿；2016—05—28修改稿 基金项目：上海市自然科学基金(16ZRl431000)资助 作者简介：汪雯翰(1979一)，男，副研究员，主要从事天然药物活性成分的研究。 ’本文通讯作者E．mail：．cn 万方数据 80 食用菌学报 第23卷 口“re“s)和枯草芽孢杆菌(肋cfffM占s“6Ⅲ括)购自南京便诊生物科技有限公司。 1．2试剂与仪器 Fisher 试剂：LB培养基、链霉素(Thermo 美国)；乙醇、石油醚、氯仿、正丁醇、芦丁、碳酸钠、碳酸氢钠、双氧水等均为分析纯，购于国药化学试剂 公司。 Max 340PC，Molecular 化工设备有限公司)；光吸收酶标仪(Spectra Devices公司，美国)；化学发光仪 (C1arifyPC，Bio-Tek公司，美国)。 1．3样品制备 参考文献[9]的方法制备液体菌种。 液体发酵菌丝体制备：250 mL三角瓶中装入120mL液体培养基(5％葡萄糖，0．5％酵母粉，0．1％ 磷酸氢二钾，0．05％硫酸镁，0．01％VB，，pH5)，接入20％液体菌种(v／v)，150r／min，28℃培养8d， 滤纸过滤得菌丝体，冻干后备用。 固体发酵菌丝体制备：1L三角瓶中装100 g大米，0．6g黄豆粉，0．05g磷酸氢二钾，0．05g硫酸 镁，52％含水量，接人10％液体菌种(v／v)，28℃培养30d，固体菌丝冻干后备用。 将樟芝子实体、液体发酵菌丝体和固体发酵菌丝体60℃烘至恒重，粉碎机粉碎，过20目筛。样 mL 品(0．5 95％乙醇中室温浸提12 g)于50 h，过滤后残渣按上述操作再浸提1次，合并滤液，减压 浓缩后依次用50mL石油醚、氯仿、正丁醇萃取3次，合并滤液，通风厨内80℃水浴蒸干，称重，4℃ 保存。 1．4抑菌实验 将金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌保存菌种分别用无菌生理盐水稀释至1×108cfu／mL，取 mL 200弘L涂布至LB平板(直径90mm)上，37℃培养12h。挑取单菌落接种到50 LB液体培养基 中，37℃，200r／min，培养6 平板(直径90mm)上，用无菌涂布棒涂布均匀。将直径为6mm的滤纸片浸泡在浓度为100 mg／mL 不同萃取物中，用无菌镊子将晾干后的滤纸片至于含供试菌的平板上，于37℃培养11h后测定抑菌圈 直径[10‘11]，每个处理3个重复，以浸泡过无水乙醇的滤纸片为阴性对照。将具有较好抑菌活性的萃取 物样品用无水乙醇稀释至浓度分别为12．5、25、50和100 mg／mL，链霉素为阳性对照，测定其抑菌 效果。 1．5抗氧化实验 选择抑菌活性较好的萃取物进行抗氧化实验。将萃取物用无水乙醇配制成浓度为1、5和15叫111L， 采用鲁米诺．邻苯三酚．CBS体系发光法测定萃取物对超氧阴离子自由基的清除率[12。将萃取物用无 水乙醇配制成浓度为0．01、0．1和1 mg／mL，使用鲁米诺．H。o。发光体系发光法测定萃取物对H。O：的 清除率[12。。阳性对照为0．1 mg／mL芦丁。 2结果与分析 2．1抑茵活性的测定结果 由表1可知，在浓度为100 mg／mL时，子实体氯仿、正丁醇萃取物和固体菌丝体氯仿萃取物对金 黄色葡萄球菌具有较好的抑制作用(抑菌圈直径≥9mm)；子实体石油醚、氯仿、正丁醇萃取物和固体 mm)，而液体发酵菌丝 发酵菌丝体氯仿萃取物对枯草芽孢杆菌具有较好的抑制作用(抑菌圈直径≥9 体的3种萃取物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均没有抑制作用。 万方数据 第2期 汪雯翰，等：樟芝子实体和菌丝体萃取物的抑菌及抗氧化活性 81 表l不同萃取物的抑菌活性 1hbIe1 Antib粒teriale艏ectof L∞mpJlDr口ms旺tracts “一”表示无抑茵困；数据为平均数±标准误(n=3) jjjj “一”noinhibition；Valuesarethemean±SD(n=3) jj jj0jj 由图1和2可知，各萃取物的作用浓度与抑菌圈直径呈现明显的正相关性，随着萃取物浓度的升 高，抑菌圈直径大小表现为递增趋势，其中子实体氯仿相对两种菌的抑制活性最好。与金黄色葡萄球 菌相比，各萃取物对枯草芽孢杆菌的抑菌效果更为明显。 口12 5mg／mL口25m咖L一50mg／mL_100mg，mL 1．●一．_一1 A B I． 1) A B t． L) E 萃取物Ex№c‘ 萃取物Ex岫ct A：子实体氯仿萃取物；B：子实体正丁醇萃取物；C：固体发酵茵丝A：子实体石油醚萃取物；B：子实体氯仿萃取物；C：子实体正丁醇 体氯仿萃取物；D：链霉素 萃取物；D：固体发酵茵丝体氯仿萃取物；E：链霉素 A：chloroformextI。actoffruitbodv；B：n．butanolextractoffruit etherextractoffruit extract A：petroleum body；B：chIoroform offruit extractoffruit C： chloroformextractof fromsolid．state body； mycelium body；C：n．ButanoI body；D：chloroform extractOf fromsolid-state culture；D：streptomycin mycelium culture；E：streptomycin 图1 萃取物浓度对金黄色葡萄球菌的抑制结果 图2萃取物浓度对枯草芽孢杆菌的抑制结果 InhiMti∞0f＆饿盯锻s L l毽l byL∞mp勋mf搬旺白眦bl毽2IⅡhiM6帅0f口．s曲d艋byc删p蛔m“皤旺h徼ts 2．2抗氧化活性 利用化学发光法测定对金黄色葡萄球菌和枯草芽 80。 l i 孢杆菌抑制效果较好的4种萃取物清除超氧阴离子和 60， 过氧化氢的能力。子实体石油醚萃取物对超氧阴离子 40— 的清除能力较弱，子实体氯仿、正丁醇萃取物和固体发 ， 酵菌丝体氯仿萃取物对超氧阴离子的清除能力与作用 2：1 广 厂 的浓度呈正相关性，其清除超氧阴离子的IC。。值分别 为5．94、1．32和1．97 mg／mL(图3)。固体发酵菌丝 体氯仿萃取物对过氧化氢的清除能力相对较弱，子实 体石油醚、氯仿和正丁醇萃取物对过氧化氢的清除能 力与作用浓度呈现正相关性，其清除过氧化氢的IC。。 万方数据 82 食用菌学报 第23卷 值分别为0．13、0．11和0．18 mg／mL(图4)。 3讨论 董so一 暑 堑 一 本研究表明，人工栽培的樟芝子实体正丁 ’誊州卜 醇和氯仿萃取物不仅对金黄色葡萄球菌和枯草 曩。or 芽孢杆菌均具有良好的抑菌效果，而且还具有 垂20一 良好的清除过氧化氢和超氧阴离子自由基的能 。一 力。利用液体发酵的菌丝体虽然成本低廉，产 一 n．． o o -J 量大，但在本实验中无抑菌活性，在开发抑菌活 A～F．同圈。 A-E：asinf00tnoteto 性相关的产品时，并不适合作为樟芝子实体的 Fig．3 替代物。固体发酵在产量和成本方面比液体发 图4不同萃取物对过氧化氢的清除能力 n昏4 酵菌丝体有更大的优势，并且固体发酵菌丝体 Hy絮≮兹：竺；：：尝ge侬出of 氯仿萃取物具有较好的抑制金黄色葡萄球菌和 枯草芽孢杆菌的作用和清除羟自由基的能力，因而在开发樟芝相关的抑菌和抗氧化保健品和功能食品 中，可以用固体发酵菌丝体部分或全部代替子实体，大幅降低生产成本。 已有的研究表明樟芝的活性成分种类多，已被分离鉴定的有近80种，主要包括多糖、萜类化合物、 超氧歧化酶、固醇类、腺苷、免疫球蛋白等，其中萜类化合物有40种左右，约占50％，有30余种活性成 分的化学结构已明确[13-18]。虽然本研究从樟芝中筛选出具有抑菌和抗氧化作用的部位，但是尚未涉及 其具体的有效成分，在以后的研究工作中将通过分离纯化和活性跟踪技术寻找到具有抑菌和抗氧化活 性的有效成份，为相关保健产品的开发提供基础，并利用细胞免疫组化、Real．timePCR和western— blotting等分子生物学技术进一步研究樟芝抑菌和抗氧化的作用机理。 参考文献 [1]戴玉成，李玉．中国六种重要药用真菌名称的说明[J]．菌物学报，2011，30(4)：515．518． 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Utilization(South)，MinistryAgriculture，P．R．China；NationalEngineering ofEdible RDCenterforEdible of Genetics Fungi；National FungiProcessing；KeyLaboratoryAgricultural and of ofLife Normal 201403，China；2 BreedingShanghai，Shanghai College Sciences，HuaiyinUniversity， ofLifesciences，Shihezi 832003，china； Huahn，Jiangsu223300，china；3C01Iege Unive“ity，Shihezi，xinjiang 4 InstituteofEastChinaSeaFisheriesResearch，chineseof 200080，China] AcademyFisherysciences，Shanghai 而f¨硷，l Abstnct： inbothsolid-stateand cuIture，and 0：肛，lg凇c口mphomr船myceliagrown submerged mushroomfruit twiceextractedwith95％ethanolfor12hat bodies，were room extractswerethenfurtherextracted with ether，chloroformand the sequentiallypetroIeum n_butanol，and anti-bacte“a1andanti-oxidantoftheseextractswere properties evaluated．Chloroformandn-butanolextracts offruitbodies，andchloroformextractsof insolid—statecultureinhibited myceliumgrown Sf口p^yfococc“s 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